广州IgM纯化操作步骤

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IgM纯化

绝大多数IgM纯化类抗体是优血蛋白不融解水，故可用双蒸水透析IgM纯化。对这种融解水的IgM纯化类抗原体可用饱和硫酸铵沉淀。沉定后可以采用顆粒排斥层析法(凝胶过滤)进一步纯化。

顆粒排斥层析，依据IgM纯化个人所得抗原体能用以Ig分子式精彩画面的制得、FITC、生物素或同位素标记。

一、原料和试剂

1. 抗血清，杂交瘤肝硬化腹水或其上清，硫酸铵沉淀粗提γ血蛋白。

2. 含0.02%NaN3 的硼酸缓冲液，PBS。

3. 透析袋；26mm×900mm层析柱。

4. 适当圆洞筛的顆粒排斥(SE)凝胶(AcA Ultragel-或Sephacryl S-200(Pharmacia LKB)。

5. 蛋白透析、SE层析和SDS-PAGE必须的其他试剂和器材。

二、操作步骤

1. 待获得样品11，000～13，000r/min(15，000～20，000×g)，4℃或室温旋蒸，除沉定。

2. 上清液对双蒸水透析4℃24小时。

3. 11，000～15，000r/min 4℃ 或室温旋蒸1h，留沉定。

4. 制得SE凝胶层析柱，以硼酸缓冲液平衡。

5. 将步骤3沉定或饱和硫酸铵粗提γ血蛋白以3～5ml硼酸缓冲液溶化，缓慢移液。

6. 以硼酸缓冲液过柱蛋白质，并收集100管(每管为柱床容量的1%)，IgM纯化在过柱液的di一个蛋白峰。

7. 收集Ig蛋白峰，分别合并，透析浓缩，紫外光分光光度计OD 280nm精确测量Ig成份，SDS-PAGE鉴定IgM纯度。

8. 以1～50mg Ig/ml硼酸缓冲液置4℃或-70℃存储。

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