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广州IgM纯化操作步骤

时间:2020-12-24 3:00:00  来源:http://gz.saiboerbio.com/news528380.html

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IgM纯化


绝大多数IgM纯化类抗体是优血蛋白不融解水,故可用双蒸水透析IgM纯化。对这种融解水的IgM纯化类抗原体可用饱和硫酸铵沉淀。沉定后可以采用顆粒排斥层析法(凝胶过滤)进一步纯化。


顆粒排斥层析,依据IgM纯化个人所得抗原体能用以Ig分子式精彩画面的制得、FITC、生物素或同位素标记。


一、原料和试剂


1. 抗血清,杂交瘤肝硬化腹水或其上清,硫酸铵沉淀粗提γ血蛋白。


2. 含0.02%NaN3 的硼酸缓冲液,PBS。


3. 透析袋;26mm×900mm层析柱。


4. 适当圆洞筛的顆粒排斥(SE)凝胶(AcA Ultragel-或Sephacryl S-200(Pharmacia LKB)。


5. 蛋白透析、SE层析和SDS-PAGE必须的其他试剂和器材。


二、操作步骤


1. 待获得样品11,000~13,000r/min(15,000~20,000×g),4℃或室温旋蒸,除沉定。


2. 上清液对双蒸水透析4℃24小时。


3. 11,000~15,000r/min 4℃ 或室温旋蒸1h,留沉定。


4. 制得SE凝胶层析柱,以硼酸缓冲液平衡。


5. 将步骤3沉定或饱和硫酸铵粗提γ血蛋白以3~5ml硼酸缓冲液溶化,缓慢移液。


6. 以硼酸缓冲液过柱蛋白质,并收集100管(每管为柱床容量的1%),IgM纯化在过柱液的di一个蛋白峰。


7. 收集Ig蛋白峰,分别合并,透析浓缩,紫外光分光光度计OD 280nm精确测量Ig成份,SDS-PAGE鉴定IgM纯度。


8. 以1~50mg Ig/ml硼酸缓冲液置4℃或-70℃存储。



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